Измерительная система  «PlantVital® 5000»

 

«PlantVital® 5000» в сравнении с другими методами, в частности с измерением флуоресценции для определения физиологических параметров хлорофиллсодержащих видов

 

Аннотация:

Измерительная система «PlantVital® 5000», основанная на измерении  кислорода с помощью детектора типа «Кларк», предназначена для решения задач  мониторинга загрязнения окружающей среды. На основании изучения временного изменения кислородного баланса хлорофиллсодержащих видов в темном и светлом циклах, получают 4 основные параметра, являющимися количественными показателями виталитета исследуемого растительного материала. Количественные индексы жизнедеятельности растений служат для: 1) установления изменения виталитета как следствие природных и антропогенных влияний (стресс различных видов) на исследумую систему, 2) наблюдения за процессами в области физиологии растений, которые нельзя обнаружить  из визуальной бонитировки, а  только с помощью очень дорогостоящих и сложных методов и 3) разработки прогнозов вегетативного и генеративного развития исследуемого материала. Другая важная область применения – 4) детальное исследование определенных ступеней фотосинтетического процесса как такового. Для исследования процесса фотосинтеза имеются 3 основных  пути: 1) определение квантового выхода флуоресценции для обнаружения использования абсорбированной энергии света для восстановления и осуществления электронно-транспортной цепи, 2) определение эмиссии кислорода как отличительного признака для сохранения энергии с помощью протонов, полученных в результате расщепления  воды (Н+) и 3) установление величины поглощения СО2 для образования гексозы через триозы  или тетрозы из поглощенного углекислого газа. Ниже в краткой форме приведено сравнение методов и отмечены особенности  PlantVital® 5000 в определенных областях.

 

Абсорпционные и флуоресцентные спектры фотосинтетического аппарата:

При облучении ультрафиолетовым или видимым светом (ФАР; фотосинтетически активная радиация) спектр флуоресценции, охватывающий  длины волн между 400 нм и 800 нм, показывает 4 ясно выраженных максимума: 440 нм (голубой), 520 нм (зеленый), 690 нм (красный) и 740 нм (темно-красный). Из этих четырех диапазонов два диапазона с длиной волны 690 нм и 740 нм принадлежат хлорофиллу «а» (хлф) в хлоропластах зеленых мезофиллклеток. Два других пика с длиной волны 440 нм и 520 нм характеризуют другие органические молекулы, которые, как правило, соединены со стенками клеток ковалентно. Обычно для характеристики фотосинтетического аппарата с помощью метода флуоресценции измеряется интенсивность флуоресценции ( установление величины квантового выхода флуоресценции, который является характеризующим параметром) и ее изменение во времени.

Изменение интенсивности флуоресценции зависит от: 1)  изменений концентрации флуоресцирующих органических молекул, 2) изменений  в проводящих свет каналах хлорофилл-«а»-содержащей системы и 3) от изменений в относительных частях распределения энергии при релаксации оптически возбужденных состояний в отдельных каналах: фотосинтез, излучательная релаксация (флуоресценция), безизлучательная релаксация  (возбуждение колебательно-вращательных состояний органических молекул, энергия которых превращается в тепловую энергию). Нарушения фотосинтеза, касающегося транспортировки электронов, проявляются в усилении флуоресценции  и могут определяться количественно.

Доказано,что флуоресценция при длине волн  440 нм и 520 нм, которая не связана с хлорофиллом «а», является константой во времени.  

Флуоресценция здоровых листьев, связанная с хлорофиллом «а» (690 нм и 740 нм), изменяется с течением времени,  благодаря чему дает возможность получить информацию о свойствах фотосинтетического аппарата. Это касается прежде всего кинетики процесса в его взаимосвязи с «эффектом Каутского».

 

Эффект Каутского: 

если лист хранился некоторое время в темноте и затем освещался светом (ФАР), то сложная энзимная система фотосинтеза начинает функционировать не сразу. Получаемая от света энергия, которая передается по электронно-транспортной цепи, принимается не сразу, что приводит к энергетическому барьеру, который проявляется в усиленном использовании флуоресцентных каналов при релаксации возбужденных состояний. Данный процесс продолжается у здорового  листа около 3 минут, пока все компоненты начинают работать синхронно  и флуоресценция хлорофилла «а» возвращается на нормальное значение.

 

Нарушения функции фотосинтетического аппарата:

     если цепь энергетического транспорта при световой реакции задержалась или совсем прервалась по другой причине, чем описанной в 3), то флуоресценция остается на высоком уровне также долго. Парадоксальное усиление флуоресценции, основывающееся на выше упомянутой задержке транспорта электронов при фотофосфорилировании, может привести к дефициту субстратов для синтеза АТФ (АДФ-дефицит или дефицит неорганического фосфата (Рi)). Такой дефицит субстрата встречается, например, при темновой реакции (фиксирование СО2), во время которой потребляется малое количество АТФ. С другой стороны, «короткое замыкание» транспорта электронов привело бы  к быстрому падению интенсивности флуоресценции (разложение фотофосфорилирования). Если лист поврежден при стрессе  (например, засуха, другие природные или антропогенные влияния), то изменение в кинетике «Каутского» (в процессе изменения интенсивности флуоресценции во время  световой реакции) может указывать на подобное влияние, так как отдельные компоненты повреждаются при стрессе неодинаково и их синхронизация осуществляется длительное время.  Метод флуоресценции позволяет в этом случае лишь количественно оценить происходящие процессы. Только измерение  эмиссии кислорода, вызываемой  фотолизом воды с выделением протонов (Н+)  с целью накопления энергии,  может дать точную количественную оценку повышенных или экстремально пониженных значений флуоресценции. Другой подходящий и часто применяемый метод для всестороннего разъяснения процесса всего  фотосинтетического механизма – измерение фиксации СО2.

 

Измерительная техника для научных исследований:

для более точного научного исследования всего процесса фотосинтеза наряду с измерением флуоресценции, наиболее изученного и применяемого метода  (методом пульс-амплитудной модуляции, ПАМ) , требуется количественное определение выделения кислорода и фиксации СО2 .
В области измерения флуоресценции применяются различные варианты, которые могут характеризовать флуоресценцию определенной части фотосинтетического аппарата. С помощью импульсного облучения и синхронного усиления измерения возможно также уловить слабые сигналы флуоресценции при наличии  более сильного фонового излучения. Таким образом, становится возможным с помощью дополнительного импульсного освещения, которое во много раз сильнее солнечного, за короткое время насытить электронно-транспортную цепь (химически восстановить). Из измеренной при этом флуоресценции можно установить  максимально возможный квантовый выход, указывающий на количество имеющегося в наличие фотосинтетически активного хлорофилла в фотосистеме
II (LHC II, light harvesting complex). Одновременно можно установить при этом минимальную флуоресценцию при длительном фотосинтезе (светлая фаза) ниже области насыщения светом.

Имеющиеся возможности в  области установления потребления кислорода при темной фазе (респирация) и количественного учета эффекта Каутского и фотосинтеза  при светлой фазе, содержатся в документации системы приборов PlantVital® 5000 фирмы INNO-Concept GmbH, Штраусберг, Германия (ссылка 1). Существенное доказательство того, каким образом  применяется сохраненная энергия для образования гексоз  через триозы (С3; Цикл Кальвина) или тетрозы (С4; Цикл Хач-Слак-Корчака), получают с помощью измерительных приборов, которые количественно определяют потребление СО2.

 

Screening-методы: 
Для  Screening-методов, позволяющих быстро и эффективно установить непосредственное влияние внешних факторов на вегетативное развитие (в некоторых случаях также генеративное развитие) хлорофиллсодержащих систем,  важно определить в каком  объеме  и в каком состоянии система готова производить для сохранения энергии – в отличие от транспорта энергии – необходимые протоны, получаемые путем водного расщепления, при котором в качестве побочного продукта выделяются молекулы кислорода. Для этой цели служат приборы определения выделяющегося при фотосинтезе кислорода, в особенности измерительная система PlantVital® 5000. Здесь следует снова отметить, что сфера применения  измерительной системы PlantVital® 5000 намного превышает область применения её для изучения определенных процессов при фотосинтезе. Обширные научные исследования по применению измерительной системы PlantVital® 5000 показали, что прибор может быть использован прежде всего для изучения физиологических процессов растений, которые невозможно определить визуальной бонитировкой (ссылка 2),  для разработки прогнозов  дальнейшего вегетативного или генеративного развития растений при заданных условиях окружающей среды (природное и антропогенное влияние, ссылка 3). Если при этом используются широко распространненные растения-индикаторы,  обладающие характеристическими свойствами, то данная измерительная система служит для решения задач мониторинга.

 

Решающие критерии для выбора системы:
Процесс фотосинтеза в своей  совокупности чрезвычайно сложный процесс, в котором участвует очень много различных молекул на различных уровнях. Влияние отдельных компонентов может быть исследовано качественно и количественно с помощью сигналов (оптических, термических, химических и др.), которые появляются на различных ступенях фотосинтетического процесса системы. Каждый такой сигнал дает информацию о деятельности определенной части целостного процесса фотосинтеза. Ни одна измерительная система не дает полную информацию о целом процессе фотосинтеза. Особенный интерес представляют следующие аспекты: а) могут  ли приведенные методы проследить за процессами в физиологии растений, которые не могут быть определены при визуальной бонитировке , б) могут ли быть выявлены из полученных  результатов измерений решающие критерии для дальнейшего целенаправленного развития растений (полезные растения, ссылка 2). Само собой разумеется,что выбор применяемой приборной техники зависит от того, какую часть целого процесса необходимо исследовать, целый ли процесс или только часть данного процесса представляет интерес и как велики издержки для получения необходимой информации об исследуемой системе. Под издержками здесь  понимаются временные затраты для получения определенной информации и финансовые затраты для приобретения необходимого основного и побочного оборудования. В дальнейшем необходимо учитывать, следуют ли измерения пробы «in vivo» или «in vitro», и необходимо  ли измерение in situ

 

Связь получаемых результатов с физиологическим состоянием растений:
Необходимо отметить, что при изложенных здесь проблемах и методах исследования речь, как правило, идет о живых системах с известным многообразием видов и свойств. Следовательно, выводы о состоянии исследуемого материала необходимо делать только на базе многократно проведенных измерений одного и того же продукта. Обычно для обработки применяют программу «Статистика». Для приведения измеренных параметров  (квантового выхода, величины выделения О2 или поглощения СО2) в соответствие с физиологическими параметрами растения, необходимо провести корреляцию. В качестве результатов получают корреляционные параметры и сигнификацию этих значений. При этом исходят из того, что при очень низких сигнификационных значениях (<0,001),  вероятность соответствия полученных  значений измерения и физиологического поведения растения  очень высока. Однако, даже при очень высокой вероятности необходимо основательно изучить вопрос каузальности (причинности) между измеряемым результатом и предполагаемой причиной.

 

Важнейшие показатели измерительной системы PlantVital® 5000 (ссылка 4): 

 

PlantVital® 5000 – простая, легко обслуживаемая измерительная система, которая великолепно подходит для наглядного изучения фотосинтеза в процессе биологического образования студентов(ссылка 5).

Необходимый для анализа растительный материал очень незначителен (от 4 мм до 8 мм в диаметре).

Возможность исследования процесса фотосинтеза у таких растений, как одноклеточные водоросли или хвойные растения.

Измерение происходит в термостабильной кювете, в которой измеряемое растение подвергается, согласно выбранной программе оператора, воздействию облучения с заданной плотностью потока фотонов. 

 

Для получения  дальнейшей информации обращайтесь:

info@inno-concept.de